Познание мира

Методы блоттинга являются эффективными методами обнаружения макромолекул, таких как белки, ДНК и РНК. Блот относится к мембране, на которой иммобилизованы биологические молекулы, такие как белки и нуклеиновые кислоты.

Первым изобретенным методом блоттинга был Саузерн-блоттинг, который Эдвин Саузерн использовал для обнаружения ДНК в 1975 году. Позднее открытые методы блоттинга названы в честь его имени:

1. Нозерн-блоттинг для обнаружения РНК.
2. Вестерн-блоттинг для обнаружения белков.

Что такое вестерн-блоттинг?

Вестерн-блоттинг — эффективный и широко используемый метод выделения определенного белка из сложного образца или смеси белков.

Он также известен как иммуноблоттинг, поскольку для обнаружения целевого белка на мембране используются зонды антител.

Он включает в себя комбинированные этапы лизиса белка, электрофореза, блоттинга и взаимодействия антиген-антитело.

Гарри Таубин впервые описал этот метод в 1979 году. Этот метод был назван У. Нилом Бернеттом Вестерн-блоттингом.

Требования к вестерн-блоттингу

1. 1X фосфатно-солевой буфер.
2. 1X буфер образца SDS.
3. Буфер для лизиса клеток.
4. Буфер передачи.
5. 1X TBST (трис-буферный физиологический раствор + полисорбат 20 (Tween 20)).
6. Блокирующий буфер (1X TBST + 5% обезжиренное сухое молоко).
7. Бычий сывороточный альбумин (BSA).
8. Первичный буфер для разведения антител (может содержать 5% BSA или 5% обезжиренного сухого молока).
9. Реагент Signal Fire ECL (помогает обнаруживать даже пиктограммы белков в методе вестерн-блоттинга).
10. Предварительно окрашенный белковый маркер.
11. Блоттинговая мембрана (нитроцеллюлозная бумага).
12. PAGE (Электрофорез в полиакриламидном геле).

Принцип вестерн-блоттинга

Белки разделяют по форме и размеру с помощью электрофореза в SDS-PAGE. Затем разделенные белки переносят на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану. На мембране они зондируются антителами, специфичными к интересующему белку. Затем происходит образование комплекса антиген-антитело. Комплекс можно обнаружить либо с помощью авторадиографии, либо с помощью вторичного антитела, связанного с ферментом.

Процедура/этапы вестерн-блоттинга

Подготовка образца и белковый блоттинг

Белок может быть извлечен из любого типа клеток или тканей путем их лизиса. Ингибиторы протеазы используются для того, чтобы белок оставался в неповрежденной форме без денатурации. Шаги включают в себя:

1. Сначала проводят аспирацию сред для культивирования клеток.
2. Выполняют промывание клеток PBS и аспирацию PBS.
3. Затем проводят лизис клеток путем добавления 1X буфера для образцов SDS (100 мкл буфера в каждую лунку для шестилуночного планшета).
4. Перенос экстракта в микроцентрифужную пробирку.

(В качестве альтернативы лизис клеток также можно проводить с использованием 1X буфера для лизиса клеток или 1X буфера RIPA)

• Обработка экстракта ультразвуком от 10 до 15 секунд для завершения процесса лизиса клеток.

(Этот шаг важен для снижения вязкости образца и особенно используется для обнаружения мембраносвязанных и ядерных белков.)

• При использовании буфера для образца SDS необходимо взять 120-микролитровую аликвоту образца и нагреть до 95-100 градусов Цельсия в течение примерно 5 минут, а затем охладить на льду.

(При использовании лизиса клеток или буфера RIPA необходимо взять 20 мкл аликвоты и добавить синий или красный загрузочный буфер, доведя конечную концентрацию до 1X. Затем его нагревают до 95 градусов Цельсия и охлаждают на льду.) 

1. Микроцентрифугирование охлажденного образца проводят в течение 55 минут при комнатной температуре.
2. Отцентрифугированный образец загружают на квадратный гель SDS-PAGE с градиентом 4-20%.
3. Загрузка образца осуществляется вместе с 10 мкл предварительно окрашенного маркера и 10 мкл биотинилированной белковой лестницы.
4. Затем гель выдерживают для запуска с использованием рабочего буфера SDS. 

Мембранный перенос

1. После того, как гель сделан, установите кассету для переноса и буфер для переноса следующим образом: влажная губка, фильтровальная бумага, гель, нитроцеллюлозная мембрана, еще одна фильтровальная бумага и губка. (Пузырьки воздуха, если они есть, должны быть удалены.)
2. Затем кассету закрывают и вставляют в передаточное устройство в соответствующем направлении.
3. Затем ее переносят на электрофорез в условиях охлаждения при 70 вольт в течение 1,5-3 часов.
4. После переноса нитроцеллюлозную мембрану удаляют и тщательно промывают 25 мл буфера TBST в течение пяти минут при комнатной температуре. 

Блокировка

1. Для блокировки мембраны ее обрабатывают 25 мл блокирующего буфера (1X TBST с 5% обезжиренным сухим молоком) при комнатной температуре в течение 1 часа.
2. Затем мембрану снова промывают 15 мл 1X TBST.

(Разные размеры относятся только к нитроцеллюлозной мембране длиной 100 см. Объем необходимо отрегулировать для мембран разного размера.)

Связывание антител

1. Первичное антитело необходимо развести 10 мл рекомендуемого буфера для разведения в соответствии с техническим описанием продукта.
2. Затем мембрану инкубируют в разбавленном антителе при осторожном встряхивании в течение ночи при 4 градусах Цельсия.
3. А в другой день мембрану сначала трижды промывают по 5 минут примерно 15 мл ТБСТ.
4. После процедуры промывки вторичное антитело, связанное с пероксидазой хрена, подходящее для данного вида, затем разбавляют от 1 до 2000 в 10 мл блокирующего буфера.
5. Затем мембрану инкубируют во вторичном антителе при осторожном встряхивании в течение часа при комнатной температуре на орбитальном шейкере.
6. Инкубированную мембрану снова промывают три раза по пять минут каждую промывку 15 мл TBST.

Обнаружение белка

1. Во-первых, готовится реагент ECL для сигнального пожара (выполняется путем смешивания одной части 2X реагента A и одной части 2X реагента).
2. Мембрану снова инкубируют в 10 мл реагента ECL при осторожном перемешивании при комнатной температуре в течение одной минуты.
3. Избыток проявляющего раствора сливают, не давая мембране высохнуть.
4. Мембрану заворачивают в пластиковый рапс и экспонируют рентгеновскую пленку, проводимую в темной комнате. Это делается в течение 10 секунд, что считается правильным временем экспозиции.
5. Белковые полосы можно наблюдать под рентгеновской пленкой.

Интерпретация результатов вестерн-блоттинга

На основе метода, используемого для вестерн-блоттинга, белки могут быть обнаружены с использованием хемилюминесценции, методов колориметрии, использования радиоизотопов, как это делается в рентгеновской пленке, и использования флуоресцентных химических веществ, меченных вторичным антителом.

Белковые полосы образца сравнивают с контролем или маркерами размера и определяют молекулярную массу в дальтонах для идентификации белка. Методы цифровой визуализации также разработаны для интерпретации разделенных белков.

Приложения вестерн-блоттинга

1. Он используется в качестве подтверждающего теста на ВИЧ.
2. Определение размера и количества белка в образце.
3. Серодиагностика туберкулезного менингита и нейроцистоциркоза.
4. Выделение белка из сложной смеси.
5. Выявление аутоиммунных заболеваний.

Преимущества вестерн-блоттинга

1. Он может обнаружить очень небольшое количество (в пикограммах) белка в образце.
2. Высокая чувствительность и специфичность 
3. Наиболее подходящий и эффективный среди других методов выявления ВИЧ.

Ограничения вестерн-блоттинга

1. Требует высокой квалификации и, следовательно, трудновыполнимо.
2. В некоторых случаях антитела связываются с другими белками, а не с интересующим белком.
3. Если первичное антитело к интересующему белку недоступно, его невозможно обнаружить.
4. Первичные антитела дороги.
5. Белки небольшого размера могут не удерживаться мембраной.
6. Появление необычных полос.