Познание мира

Репликация ДНК — это процесс создания двух идентичных копий ДНК из одной исходной молекулы ДНК.

1. ДНК состоит из миллионов нуклеотидов, которые состоят из сахара дезоксирибозы, фосфата и основания. 
2. Комплементарное соединение этих оснований сохраняет двойные нити нетронутыми. Чтобы сделать две копии одной ДНК, эти водородные связи между основаниями должны быть разорваны, чтобы начать репликацию.
3. Репликация ДНК является полуконсервативной, что означает, что каждая цепь ДНК действует как матрица для синтеза новой комплементарной цепи. Полуконсервативная, потому что после синтеза молекулы ДНК одна цепь от родительской, а другая цепь является вновь образованной цепью. 
4. Репликация ДНК начинается с взятия одной молекулы ДНК и получения двух дочерних молекул, причем каждая вновь синтезированная молекула содержит одну новую и одну старую нити. 
5. Репликация ДНК — это процесс, с помощью которого ДНК копирует себя. Как бы легко это ни звучало, это сложный процесс, происходящий внутри наших клеток, и многие ферменты, белки и ионы металлов должны работать согласованно.

Ферменты и белки, используемые при репликации ДНК

Нуклеазы

1. Нуклеаза — это фермент, который может расщеплять фосфодиэфирные связи между нуклеотидами.
2. На основании места их расщепления их называют экзо- и эндонуклеазами.
3. Экзонуклеазы отщепляют нуклеотиды с соответствующих концов. В соответствии с этим фактом, эти экзонуклеазы проявляют активность в обоих направлениях с 5 ‘на 3’ и с 3 ‘на 5’.
4. Эндонуклеазы действуют на область в середине целевого нуклеотида. Они также являются эндонуклеазами, которые избирательны по отношению к молекуле, которую они расщепляют, и подразделяются на ДНКазу для расщепления ДНК и РНКазу для расщепления РНК.
5. Рестрикционная эндонуклеаза — расщепляют ДНК на фрагменты.
6. Чтобы расщепить ДНК, эндонуклеаза рестрикции делает два разреза, по одному через каждый сахарно-фосфатный остов двойной спирали ДНК. Эти эндонуклеазы распознают определенную последовательность нуклеотидов и образуют двухцепочечный разрез в ДНК.

ДНК-полимераза

1. ДНК-полимеразы — это фермент, который отвечает за добавление новых нуклеотидов и синтез новой цепи ДНК, взяв старую фрагментированную цепь в качестве матрицы.
2. ДНК-полимеразы также обладают экзонуклеазной активностью, которая отсекает неправильно добавленные нуклеотиды и позволяет репликации ДНК происходить без ошибок.
3. ДНК-полимераза имеет множество типов и функций в зависимости от клетки, в которой она находится. 
4. ДНК-полимераза Ι представляет собой репарационную полимеразу с экзонуклеазной активностью от 5 ‘до 3’ и от 3 ‘до 5’. 
5. ДНК-полимераза ΙΙ обладает экзонуклеазной активностью от 3 ‘до 5’ и участвует в репарации ДНК с активностью полимеразы от 5 ‘до 3’.
6. ДНК-полимераза ΙΙΙ является основным ферментом, участвующим в репликации ДНК E.coli. Обладает экзонуклеазной активностью от 3 ‘до 5’ и полимеразной активностью от 5 ‘до 3’.
7. В эукариотических клетках имеется пять ДНК-полимераз: ДНК-полимераза α, β, γ, δ и ε. 
8. ДНК-полимераза α представляет собой репаративную полимеразу с экзонуклеазной активностью от 3 ‘до 5’ и активностью полимеразы от 5 ‘до 3’.
9. ДНК-полимераза β — это полимераза репарации.
10. ДНК-полимераза γ проявляет полимеразную активность от 5 ‘до 3’ и активность экзонуклеаз от 3 ‘до 5’, она участвует в репликации митохондриальной ДНК. 
11. ДНК-полимераза δ проявляет экзонуклеазную активность от 3 ‘до 5’ и полимеразную активность от 5 ‘до 3’. Этот фермент участвует в синтезе отстающей цепи.
12. ДНК-полимераза ε проявляет активность экзонуклеаз от 3 ‘до 5’ и от 5 ‘до 3’. Этот фермент не только восстанавливает, но и эффективно синтезирует ведущую цепь в направлении от 5 ‘к 3’. Это основной фермент, участвующий в репликации ДНК.

ДНК-лигаза

1. ДНК-лигаза — это особый тип фермента, который облегчает соединение нитей ДНК вместе, катализируя образование фосфодиэфирной связи.
2. Этот фермент соединяет 3′-гидроксильную группу одного нуклеотида с 5′-фосфатным концом другого нуклеотида за счет АТФ.

ДНК-хеликаза

1. ДНК-хеликаза — это моторный белок, который направленно движется вдоль фосфодиэфирного остова нуклеиновой кислоты, разделяя два нуклеотида молекулы ДНК.
2. Они разделяют двухцепочечные молекулы ДНК на одноцепочечные, что позволяет копировать каждую нить.
3. ДНК-хеликаза продолжает раскручивать двойную спираль ДНК и, таким образом, образует структуру, называемую репликационной вилкой. 
4. Это энергетический процесс, поскольку он включает разрыв водородных связей между отожженными нуклеотидными основаниями. 

ДНК-праймаза

1. Праймаза — это фермент, способный синтезировать короткие участки последовательностей РНК, известный как праймер.
2. Праймеры являются неотъемлемой частью репликации ДНК. 
3. ДНК-праймаза может добавлять нуклеотид только к уже существующей 3′-гидроксильной группе, которая, таким образом, обеспечивается праймерами.
4. Как мы видим, праймеры представляют собой короткие отрезки РНК, но репликация — это ДНК, поэтому после удлинения цепей нуклеотидов эти праймеры заменяются ДНК. 

ДНК-топоизомераза

1. ДНК-топоизомераза — это класс ферментов, которые снимают натяжение спирали во время транскрипции и репликации, создавая временные разрывы в фосфатном остове на одной или обеих цепях ДНК.
2. Это напряжение возникает, когда молекула ДНК раскручивается из-за активности геликазы и образует вилку репликации. 
3. Топоизомераза ДНК класса делает одноцепочечный разрыв, чтобы расслабить спираль и ускорить процесс.
4. Класс ΙΙ Топоизомераза ДНК разрывает обе нити спирали ДНК, этот класс топоизомераз также очень важен во время клеточного цикла для конденсации хромосом.

Одноцепочечные связывающие белки

1. Одноцепочечный связывающий белок (SSB) — это ДНК-связывающие белки, которые связываются с одноцепочечной ДНК для облегчения репликации ДНК.
2. Белки SSB предотвращают затвердевание цепей во время репликации ДНК. Также защищает цепи от расщепления нуклеазами и предотвращает перемотку ДНК. 
3. Эти белки дестабилизируют спиральные дуплексы, так что ДНК-полимераза может удерживать ДНК во время репликации, рекомбинации и репарации ДНК.
4. Удаляет нежелательные вторичные структуры на цепях для облегчения доступа цепей к машинам, участвующим в репликации ДНК.
5. Таким образом, белки SSB стабилизируют структуру одноцепочечной ДНК, которая важна для геномной прогрессии.

Список из 7 ферментов и белков, используемых в репликации ДНК:

1. Нуклеазы
2. ДНК-полимераза
3. ДНК-лигаза
4. ДНК-хеликаза
5. ДНК-праймаза
6. ДНК-топоизомераза
7. Одноцепочечные связывающие белки

Этапы репликации ДНК

Шаг 1: формирование вилки репликации

1. Прежде чем ДНК сможет реплицироваться, эта двухцепочечная молекула должна раскрутиться на две одноцепочечные цепи, чтобы инициировать процесс репликации.
2. ДНК раскручивается, когда комплементарное спаривание двухцепочечных оснований разрывается.
3. Эти специфические кодирующие области называются источником репликации (Ori), и таким образом начинается процесс репликации.
4. Эти источники нацелены на белки-инициаторы, которые продолжают привлекать больше белков, которые могут помочь процессу репликации, образуя вилку репликации вокруг Ori. 
5. Внутри этого репликационного белкового комплекса находится ферментная ДНК-геликаза, которая начинает раскручивать ДНК с ее Ori и обнажает две нити, напоминающие Y-подобную структуру, называемую репликационной вилкой. 
6. Активность геликазы вызывает топологический стресс для незакрученной нити, образующей сверхспиральную ДНК, этот стресс снимается топоизомеразой за счет отрицательной суперспирализации.
7. Вилка репликации является двунаправленной, одна цепь ориентирована в направлении от 3 ‘до 5’ (ведущая цепь), а другая цепь ориентирована в направлении от 5 ‘до 3’ (отстающая цепь), но добавление нуклеотидов происходит только в направлении от 5 ‘до 3’.
8. Формирование репликационной вилки, обнажающей две однонитевые нити, знаменует начало инициации.

Шаг 2: инициирование

1. Одна нить проходит от 3 ‘к 5’ направлению к репликационной вилке и называется ведущей цепью, а другая нить проходит от 5 ‘до 3’ от репликационной вилки и упоминается как отстающие нити. 
2. К этой открытой одноцепочечной ДНК прикреплены белки SSB, чтобы предотвратить откат ДНК и стабилизировать ее.
3. После этого другой фермент ДНК-праймаза вступает в действие для синтеза короткого участка праймера РНК, который обеспечивает свободную 3′-гидроксильную группу для ДНК-полимеразы, которая теперь может добавлять нуклеотиды и удлинять новую цепь нуклеотидов.

Шаг 3: удлинение

1. Теперь, когда к двум одноцепочечным ДНК добавлен праймер, эти цепи действуют как матрица для синтеза новых ДНК.
2. Ферментная ДНК-полимераза синтезирует новый нуклеотид, соответствующий матрице, и добавляется к свободной 3′-гидроксильной группе, обеспечиваемой праймером в каждой одноцепочечной ДНК.
3. Ведущая цепь проходит от 3 ‘к 5’, поэтому добавление нуклеотидов ДНК-полимеразой происходит от 5 ‘к 3’ направлению. По мере развития репликационной вилки добавление нуклеотида происходит непрерывно, поэтому праймер требуется только один раз.
4. Однако отстающие нити антипараллельны и проходят от 5′-направления к 3′-направлению, непрерывное добавление нуклеотидов невозможно по мере продвижения репликационной вилки, ДНК-полимераза не может добавлять комплементарные нуклеотиды к 5′-концу. Следовательно, требуется несколько праймеров.
5. Благодаря этому явлению синтез нуклеотидов ДНК из отстающих цепей происходит фрагментарно. Эти фрагменты называются фрагментами Окадзаки.
6. Следовательно, ведущая цепь, использующая только один праймер, непрерывно синтезирует нуклеотиды, в то время как отстающая цепь использует несколько праймеров и, таким образом, синтезирует нуклеотиды прерывисто. 

Шаг 4: прекращение действия

1. Праймеры РНК как ведущей, так и отстающей цепей отщепляются или разрушаются под действием экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы, а образовавшиеся таким образом зазоры или промежутки заполняются ДНК и закрываются ферментной ДНК-лигазой.
2. ДНК-полимераза также демонстрирует активность корректуры и проверяет, удаляет и заменяет любые ошибки.
3. Интересно, что в эукариотических организмах, имеющих линейную ДНК, когда праймер РНК на 5′-конце дочерней цепи удаляется, не существует предшествующего 3′-ОН, так что ДНК-полимераза может использовать его для замены ДНК.
4. Итак, на 5′-конце дочерних цепей есть разрыв (отсутствующая ДНК). Эта недостающая ДНК может вызвать потерю информации, содержащейся в этой области. Этот пробел необходимо заполнить до следующего раунда репликации.
5. Для решения этой проблемы конечной репликации исследователи обнаружили, что используются линейные концы ДНК, называемые теломерами, которые содержат специфические повторы, богатые G: C. Эти последовательности известны как последовательности теломер.
6. Эти теломерные последовательности ничего не кодируют, но необходимы для заполнения пробелов в дочерней цепи и поддержания целостности ДНК.
7. В конце концов, вилки репликации заканчиваются на завершающих узнающих последовательностях.

Применение репликации ДНК

1. Репликация ДНК делает возможной передачу генетической информации от одного поколения к другому.
2. Это важное явление, происходящее внутри наших клеток, которое позволяет телу поддерживать гомеостаз и целостность тела.
3. Имея доступную информацию о репликации ДНК, научные сообщества сегодня имеют правильное представление о секвенировании генома, которое теперь применяется в различных областях, от клинической диагностики до возможного лечения генетических заболеваний.
4. Репликация ДНК сделала возможным секвенирование всего генома человека.
5. Клонирование генов стало возможным благодаря репликации ДНК.
6. Ферменты, участвующие в репликации ДНК, в настоящее время широко изучены в связи с их более широким применением. Недавняя революционная технология Cas9 / CRISPR, в которой нуклеазы используются для расщепления нужной части ДНК и замены ее необходимыми нуклеотидами, является ярким примером того, как мы можем использовать эти ферменты и добиться в них потенциальных улучшений, тем самым расширяя и исследуя возможности их использования.
7. Полимеразная цепная реакция использует ДНК-полимеразы для многократной репликации ДНК in vitro и находит множество применений в диагностике, секвенировании и технологии рекомбинантных ДНК.
8. Образование комплементарной ДНК (кДНК) также можно рассматривать как пример более широкого применения ферментов, участвующих в репликации ДНК.