Познание мира

Что такое микроскоп?

Микроскоп — это оптический прибор с одной или несколькими системами линз, который используется для получения четкого увеличенного изображения мельчайших объектов или структур, которые невозможно увидеть невооруженным глазом.

Микроскоп — это прибор для наблюдения за детальной структурой небольших объектов. Очень маленькие объекты, которые не видны невооруженным глазом, такие как клетки, микроорганизмы, вирусы, наночастицы, субклеточные структуры и т. д., рассматриваются с помощью микроскопа. Такие объекты, которые можно увидеть только с помощью микроскопа, называются «микроскопическими».

Существуют различные типы микроскопов, такие как световой микроскоп, микроскоп темного поля, фазово-контрастный микроскоп, электронный микроскоп, флуоресцентный микроскоп и т. д.

Что такое микроскопия?

Микроскопию можно определить как научную дисциплину, использующую микроскопы для получения увеличенного изображения объектов, которые невозможно увидеть невооруженным глазом.

Это очень важный инструмент в биологии и нанотехнологиях. В микробиологии это один из наиболее важных инструментов, используемых для наблюдения за микробными клетками. 

Микроскопию можно разделить на 4 типа;

Оптическая микроскопия (световая микроскопия)

Оптическая микроскопия (световая микроскопия) — это метод микроскопии, в котором для проявления изображения объекта используется проходящий видимый свет, естественный или искусственный. Это самый распространенный вид микроскопии. Далее он подразделяется на несколько групп.

Микроскопия светлого поля

Микроскопия светлого поля — самый простой и наиболее распространенный тип. В этом методе используется простой или сложный световой микроскоп. Он использует проходящий видимый свет для создания увеличенных изображений.

Он имеет низкую контрастность, низкое оптическое разрешение, требует окрашивания и имеет ограниченное увеличение около 1300X.

Он прост и может использоваться для наблюдения за живыми клетками и микроорганизмами. 

Микроскопия в темном поле

В микроскопии темного поля используются микроскопы с темным фоном. Отраженный свет используется вместо проходящего света для формирования увеличенного изображения. 

Он используется для наблюдения за очень тонкими образцами и подвижностью жгутиков и ресничек. 

3-фазная контрастная микроскопия

В фазово-контрастной микроскопии используется фазово-контрастный микроскоп. Он преобразует фазовые сдвиги в разницу в интенсивности света, создавая более контрастные изображения. 

Используется для наблюдения за живыми клетками и клеточными структурами.

Флуоресцентная микроскопия

Флуоресцентная микроскопия — это метод микроскопии, в котором используется флуоресцентный микроскоп с источником УФ-излучения. Он широко используется для обнаружения антигенов, антител и других макромолекул. 

Конфокальная микроскопия

Конфокальная микроскопия — это новый метод микроскопии, в котором используется сфокусированный лазерный луч. Он используется для получения трехмерных изображений биологических образцов с высоким разрешением.

Дифференциальная интерференционная контрастная микроскопия

Дифференциально-интерференционно-контрастная микроскопия — это новый метод микроскопии, используемый в неокрашенных и прозрачных образцах для повышения контрастности их изображения. 

Электронная микроскопия

Электронная микроскопия — это метод микроскопии, в котором используется пучок электронов для создания сильно увеличенного изображения микроскопических образцов.

В этом методе используются электронные микроскопы. 

Сканирующая зондовая микроскопия

Сканирующая зондовая микроскопия — это метод микроскопии, в котором используется физический зонд для сканирования образцов и формирования увеличенных изображений. Это позволяет измерить характеристики поверхности образца.

Рентгеновская микроскопия

Рентгеновская микроскопия — это метод микроскопии, в котором для получения увеличенного изображения образца используется мягкое рентгеновское излучение. 

История

1. В I веке нашей эры римляне изобрели стекло и использовали его для увеличения предметов.
2. В начале 14 веке нашей эры очки изготавливались итальянскими производителями очков.
3. В 1590 году два голландских мастера очков Ганс и Захариас Янсен создали первый микроскоп. Это была простая трубка с системой из 2 линз и 9-кратным увеличением.
4. В 1670 году Роберт Гук, английский химик, математик, физик и изобретатель, разработал составной микроскоп. Он первым разработал трехлинзовый микроскоп. 
5. В 1675 году Антон Ван Левенгук превратил стеклянный шар в выпуклую линзу и использовал ее для изготовления однолинзового микроскопа с 270-кратным увеличением. С помощью этого микроскопа он впервые наблюдал за бактериальными клетками. 
6. В 1729 году Честер Мур Холл впервые представил и применил в микроскопе ахроматические линзы. 
7. В 1830 году Джозеф Джексон Листер предложил использовать несколько маломощных линз для достижения четкого увеличения. 
8. В 1878 году Эрнст Аббе, немецкий физик и ученый-оптик, разработал математическую теорию, связывающую длину волны с разрешением изображения. Он первым разработал и применил иммерсионные линзы с водой и маслом. 
9. В 1903 году Ричард Зигмонди изобрел ультрамикроскоп.
10. В 1932 году Фриц Цернике изобрел фазово-контрастный микроскоп. 
11. В 1938 году Макс Нолл и Эрнст Руска изобрели первый электронный микроскоп. Это был просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ). Он использовал пучок электронов вместо света, чтобы сделать увеличенное изображение.  
12. В начале 1940-х годов русский физик Сергей Юрьевич Соколов разработал концепцию ультразвукового микроскопа. Но только в 1970 году в Америке была разработана его рабочая модель. 
13. В 1942 году Эрнст Руска усовершенствовал ПЭМ до сканирующего электронного микроскопа (СЭМ). 
14. В 1951 году британские физики Уильям Никсон и Эллис Кослетт изобрели рентгеновский микроскоп. 
15. В 1981 году Герд Бинниг и Генрих Рорер изобрели сканирующий туннельный микроскоп. Это позволило нам получить трехмерное изображение объекта.

Термины микроскопии

Что такое увеличение?

Увеличение — это процесс получения увеличенного изображения образца с помощью системы линз. В микроскопе увеличение можно рассчитать, вычислив произведение увеличения окуляра на увеличение используемого объектива.

Что такое показатель преломления?

Показатель преломления можно определить как отношение скорости света в вакууме к скорости света в среде (веществе). Это мера искривления луча света при переходе из одной среды в другую. 

Что такое разрешение?

Разрешение можно определить как кратчайшее расстояние между двумя точками на образце, которые можно различить с помощью микроскопа на его изображении. Это способность микроскопа различать детали на образце.

Как работает микроскоп?

В простом световом микроскопе тонкий образец, содержащий предметное стекло, помещается на предметный столик микроскопа.

Пучок света проходит через конденсор на образец. Свет, исходящий от образца, попадает на объектив. Проходя через объективы, прошедшие лучи рассеиваются так, что создается впечатление, что они исходят от более крупных объектов. 

Затем свет фокусируется на линзе окуляра. Эта линза дополнительно увеличивает предварительно увеличенное изображение, поступающее от объективов.

Части микроскопа

Современные микроскопы имеют дополнительную электронику и устройства отображения.

Типичный микроскоп состоит из следующих частей:

Осветитель (источник света)

Микроскопический осветитель является источником света. В некоторых составных микроскопах используется зеркало, которое отражает свет от внешнего источника на образец. В других оптических микроскопах в качестве постоянного источника света используются различные электрические лампочки низкого напряжения. В качестве осветителей обычно используются вольфрамово-галогенные лампы, ксеноновые лампы мощностью 75-150 Вт, оловянно-галогенные лампы, ртутные лампы и т. д. Выбор типа лампы основан на требованиях к интенсивности и длине волны освещения.

Диафрагма

Диафрагма представляет собой регулируемый аппарат, который регулирует количество света, попадающего на образец. Он расположен чуть выше осветителя. Регулирует интенсивность и размер луча света, попадающего на образец. 

Конденсор

Конденсор представляет собой систему линз, которая собирает и фокусирует световые лучи, исходящие от осветителя, на исследуемый образец. Это полезно при работе с большим увеличением 400X или выше. 

В современных и качественных микроскопах используется конденсор Аббе. Он контролирует диаметр луча света, попадающего на образец, и регулирует яркость, освещенность и контрастность проявляющегося изображения. 

Ручка фокусировки конденсора

Ручка фокусировки конденсатора — это регулировочная ручка, которая перемещает конденсор вверх и вниз. Это помогает контролировать фокус света, проходящего от конденсора к образцу.

Стопор стойки

Стопор стойки — еще одно регулировочное устройство, которое регулирует, насколько близко столик может подниматься, не задев линзу объектива. Предотвращает удар предметного стекла о линзу объектива и повреждение образца, а также линзы.

Сцена

Сцена представляет собой плоскую площадку, на которую для просмотра помещается предметное стекло с образцом. Столик имеет центральное отверстие, через которое на образец попадает сфокусированный свет от конденсора. Он содержит двухступенчатые зажимы для удержания ползуна в фиксированном положении. 

Большинство микроскопов имеют механический столик. Этот тип столика позволяет механически перемещать слайды с помощью ручек управления предметным столиком. 

Ручки управления сценой

Ручки управления сценой — это ручки, используемые для механического перемещения сцены. Есть две ручки: одна для движения влево и вправо, а другая для движения вперед и назад.

Носовая часть 

Носовая часть представляет собой подвижную круглую конструкцию, в которой размещены все объективы. Ее также называют вращающейся башней. Она соединена с трубкой корпуса и находится прямо над сценой. Её можно вращать по часовой стрелке или против часовой стрелки для увеличения или уменьшения соответственно. 

Объектив 

Объектив – это линза, расположенная ближе всего к образцу. Они крепятся на носовой части. В стандартном микроскопе имеется от 3 до 4 объективов с разным увеличением, а именно: 4Х, 10Х, 40Х и 100Х. Линзы объектива сначала принимают свет, прошедший от образца, и впервые увеличивают изображение.

Объективы имеют цветовую маркировку и разные размеры. Размер и цвет зависят от силы линзы. Самая маленькая линза имеет наименьшую оптическую силу, и постепенно самая длинная линза будет иметь наибольшую оптическую силу. Объективы с большим увеличением, т.е. 40X и 100X, являются убирающимися, т.е. их конец можно задвинуть внутрь. В большинстве оптических микроскопов объективы с увеличением в 100 и более раз относятся к масляно-иммерсионному типу.

Трубка (Голова)

Трубка (головка) представляет собой цилиндрическую металлическую трубку, которая удерживает линзу окуляра на одном конце и соединяется с носовой частью на другом конце. Её также называют тубусом корпуса или тубусом окуляра. Она соединяет линзу окуляра с линзой объектива. Свет, исходящий от объективов, будет преломляться внутри этой трубки.  

Окуляр (окулярная линза)

Окуляр — это линза, расположенная ближе всего к глазу. Она расположена в верхней части микроскопа. Эта часть используется для просмотра образца.  

Эти линзы имеют разную степень увеличения от 5 до 30 крат, но наиболее распространены линзы для окуляров с увеличением 10 или 15 крат.

Диоптрийная регулировка

Диоптрийная регулировка — это ручка управления, присутствующая только в бинокулярных микроскопах, которая используется для изменения фокуса на одном окуляре. Она используется для коррекции любой разницы в зрении и компенсации различий в зрении между двумя глазами.

Ручки регулировки

Регулировочные ручки — это ручки управления, используемые для фокусировки микроскопа на образце. Эти ручки бывают двух типов:

Ручка точной регулировки

Используется для точной настройки. Это ручка меньшего размера, которая используется для очень медленного перемещения сцены вверх или вниз. При каждом повороте ручки точной регулировки предметный столик проходит очень небольшое расстояние. Используется для повышения резкости изображения. 

Ручка грубой регулировки

Используется для фокусировки изображения при малом увеличении. Это большая ручка, которая используется для очень быстрого перемещения сцены вверх или вниз. Сцена быстро поднимается или опускается. 

Основание

Основание — это самая нижняя часть микроскопа, поддерживающая всю конструкцию микроскопа. Обеспечивает устойчивость микроскопа. Осветитель, выключатели света и система электропроводки установлены в основании.

Выключатель света

Выключатель света представляет собой электрическое устройство управления. Выключатели света используются для включения и выключения осветителя.

Регулировка яркости

Система регулировки яркости контролирует напряжение, подаваемое на лампочку, контролируя интенсивность (яркость) лампочки.

Типы микроскопов

Простой микроскоп

Простой микроскоп — это тип микроскопа, в котором для увеличения используется одна выпуклая линза с малым фокусным расстоянием. Как правило, увеличение составляет около 10X.

Простой принцип работы микроскопа

При помещении образца в фокус выпуклой линзы микроскопа на наименьшем расстоянии формируется мнимое прямое и увеличенное изображение. Детали простого микроскопа, зеркало в качестве осветителя, выпуклая линза для увеличения, предметный столик и металлическая подставка с основанием.

Использование простого микроскопа

1. Используется для изучения морфологии насекомых, водорослей и грибов.
2. Используется при изучении типа и компонентов почвы
3. Используется в мастерских по ремонту электроники для ремонта часов, мобильных телефонов и других микроустройств и компонентов.
4. Используется ювелирами для проверки качества бриллиантов, рубинов и других драгоценных камней.
5. Используется для изучения деталей гравюр, надписей с мелкими буквами и т. д.

Ограничение простого микроскопа

1. Имеют очень маленькое увеличение, до 10.
2. Отсутствие механической сцены.
3. Для четкого зрения требуется тонкий окрашенный образец.
4. Очень низкое разрешение и контрастность изображения.

Составной микроскоп

Составной микроскоп — это тип микроскопа, в котором используется видимый свет для освещения и система с несколькими линзами для увеличения образца. Как правило, он состоит из двух линз: линза объектива и линза окуляра. Он может увеличивать изображения до 1000 раз. Его увеличительная сила равна произведению увеличительной силы используемого объектива и линзы окуляра. 

Это наиболее широко используемый микроскоп в биологических областях, таких как медицина, микробиология, науки о жизни, патология, гематология, анатомия, молекулярная биология и т. д. 

Принцип работы составного микроскопа

Когда свет фокусируется через конденсор на образец, помещенный на предметный столик, свет, проходящий через образец, улавливается линзой объектива. На трубке корпуса формируется увеличенное изображение. Это называется основным изображением. Свет преломляется в трубке тела и проходит через окулярную линзу. При прохождении через окулярную линзу изображение увеличивается во второй раз. Это называется вторичным изображением. 

Составные части микроскопа

1. Осветитель (Источник света).
2. Диафрагма (Ирис).
3. Конденсатор.
4. Ручка фокусировки конденсатора.
5. Стоп-стойка.
6. Ручки управления сценой.
7. Носовая часть.
8. Объектив.
9. Трубка (голова).
10. Окуляр (окулярная линза).
11. Диоптрийная регулировка.
12. Ручки регулировки.
    а. Ручка точной регулировки.
    б. Ручка грубой регулировки.
13. Основание.
14. Выключатель.
15. Регулировка яркости.

Использование составного микроскопа

1. Используется в микробиологии для изучения морфологии микроорганизмов. 
2. Используется в гистопатологии для изучения тканей, цитопатических эффектов, опухолей и т. д.
3. Используется в цитологии для изучения клеточной структуры различных типов клеток.

Ограничения составного микроскопа

1. Невозможно получить изображение объектов меньше длины волны видимого света (0,4 мкм).
2. Имеет более низкое разрешение и контрастность изображения
3. Нельзя использовать для просмотра живых внутренних структур.
4. Требуется тонкий и окрашенный образец.

Фазово-контрастный микроскоп

Фазово-контрастный микроскоп — это оптический микроскоп, который преобразует небольшие фазовые сдвиги света в разницу в интенсивности света, создавая более контрастные изображения, которые могут быть легко обнаружены человеческим глазом. Когда свет проходит через прозрачные образцы, возникает небольшой фазовый сдвиг, который не может быть обнаружен нашими глазами. С помощью фазовых пластин эти небольшие фазовые сдвиги преобразуются в изменения амплитуды света. Это изменение амплитуды можно наблюдать как различия в контрасте изображения.

Его можно использовать для наблюдения за живыми клетками в их естественном состоянии без окрашивания или фиксации. Прозрачные образцы и субклеточные органеллы могут быть четко видны с лучшим контрастом.  

Из-за разницы в толщине и показателе преломления различных частей образца при прохождении света через образцы возникает небольшой фазовый сдвиг световых лучей. Этот фазовый сдвиг можно изменить на разницу в интенсивности света (яркости), что сделает изображение более контрастным.

Принцип фазово-контрастного микроскопа

Свет от осветителя фокусируется на образце через кольцо конденсора. Этот свет проходит через разные области образца, имеющие разные показатели преломления и толщины. Световые лучи, проходящие через область с более высоким показателем преломления и толщиной, будут испытывать большую фазовую задержку, чем лучи, проходящие через область с более низким показателем преломления и толщиной. Эти фазовые сдвиги не видны обычному человеческому глазу. Оптическое устройство, такое как фазовая пластина, преобразует эти фазовые сдвиги в изменение яркости, что создает заметные различия в контрасте конечного изображения.

Части фазово-контрастного микроскопа

Он содержит все части составного микроскопа и дополнительно содержит две оптические части, конденсорное кольцо и фазовую пластину для фазового контраста. 

Кольцевой конденсатор

Его также называют фазовым конденсатором. Это оптическая часть, которая фокусирует узкий полый конус светового луча на исследуемом образце. 

Представляет собой черную (светопоглощающую) круглую пластину с прозрачным кольцевым кольцом/канавкой. Свет проходит через кольцевое кольцо и падает на образец, помещенный на предметный столик. В микроскопе он помещается ниже конденсора. 

Фазовая пластина

Это еще одна оптическая часть, которая избирательно изменяет фазу и амплитуду света, исходящего от образца. Он расположен над задней фокальной плоскостью объектива. 

Это круглая прозрачная пластина, поверхность которой можно разделить на две части. Часть, на которую сфокусировано кольцо конденсатора, называется сопряженной зоной. Оставшаяся часть в совокупности называется дополнительной областью. 

Дополнительная область покрыта светозащитным материалом, таким как фторид магния. 

Фазовая пластина бывает двух типов: пластина положительной фазы, имеющая более тонкую сопряженную область, и пластина отрицательной фазы, имеющая более толстую сопряженную область.

Использование фазово-контрастного микроскопа

1. Наблюдение за живыми клетками в их естественной форме.
2. Используется в микробиологии для наблюдения за простейшими, диатомовыми водорослями, планктонами, цистами, гельминтами и личинками.
3. Используется для изучения субклеточных структур и клеточных процессов.
4. Используется для исследования тонких срезов тканей.
5. Используется для изучения литографического рисунка и дисперсии латекса, осколков стекла и кристаллов.

Ограничения фазово-контрастного микроскопа

1. Не подходит для толстых образцов.
2. Конденсорное кольцо ограничивает апертуру и, следовательно, снижает разрешение. 

Флуоресцентный микроскоп

Флуоресцентный микроскоп — это оптический микроскоп, использующий флуоресценцию или фосфоресценцию для создания увеличенного изображения образца. Это модифицированный световой микроскоп. Этот микроскоп можно использовать для изучения живых клеток и клеточных органелл, выявления специфических белков, антигенов и иммуноглобулинов. У них очень высокая чувствительность.

Принцип флуоресцентного микроскопа

Работает по принципу флуоресценции. Когда монохроматический свет попадает на объект, окрашенный флуорофором, он повторно излучает свет. Излучаемый свет регистрируется для формирования увеличенного изображения образца.

Образец окрашивают флуорофором и помещают на предметный столик. Генерируется свет высокой энергии, который проходит через фильтр. Этот фильтр пропускает только свет с определенной короткой длиной волны (УФ-диапазон), способный возбуждать флуоресцентную молекулу, и блокирует весь свет с другой длиной волны.

Отфильтрованный свет отражается на образец с помощью дихроичного фильтра. Флуорофор поглощает световые лучи, которые заставляют электрон возбуждаться в более высоком энергетическом состоянии. Возбужденные электроны возвращаются в основное состояние, высвобождая возбужденную энергию в виде световых лучей с большей длиной волны. 

Излучаемый свет проходит через дихроичное зеркало и попадает на эмиссионный фильтр. Этот фильтр блокирует свет с короткой длиной волны и позволяет свету с большей длиной волны проходить через окулярные линзы к детекторной системе.

В детекторе формируется увеличенное изображение. Фон воспринимается как темный, а изображение кажется ярким. 

Части флуоресцентного микроскопа

Типичный флуоресцентный микроскоп состоит из следующих частей:

1. Флуорофор (флуоресцентный краситель)

Это химические соединения, обладающие свойством флуоресценции, т. е. переизлучающие свет при возбуждении светом. Это комбинации нескольких ароматических или планарных соединений с несколькими пи (π) связями. Большинство из них являются органическими соединениями. Они окрашивают широкий спектр биомолекул и клеточных структур. Некоторые распространенные флуорофоры: флуоресцеин, родамин, цианин, антрахинон, акридиновый оранжевый, акридиновый желтый, аурамин, малахитовый зеленый и т. д.

2. Источник света

Обычно ртутная лампа используется для получения УФ-излучения. Кроме того, используются ксеноновые дуговые лампы, мощные светодиоды и лазеры. Они излучают свет высокой энергии.

3. Фильтр возбуждения

Это полосовой фильтр, который пропускает свет с короткой длиной волны, который может возбуждать флуорофор, и блокирует все другие возбуждающие и длинноволновые излучения. Их помещают на пути освещения, т.е. на пути перед образцом.

4. Эмиссионный фильтр

Это еще один полосовой фильтр, который пропускает весь свет, излучаемый флуорофором, и блокирует весь другой свет в диапазоне возбуждения. Они размещаются на пути визуализации, т.е. на пути после образца. Это обеспечивает максимально темный фон и более яркое изображение с высокой контрастностью. 

5. Дихроичное зеркало (расщепитель луча )

Это специальное зеркало, которое избирательно отражает или пропускает свет определенной длины волны. Он расположен между фильтром возбуждения и фильтром излучения под углом 45°. Он отражает свет от фильтра возбуждения на флуорофор и передает излучаемый свет на фильтр излучения.

Типы флуоресцентных микроскопов

Существуют различные типы флуоресцентных микроскопов.

1. Эпифлуоресцентный микроскоп

Эпифлуоресцентный микроскоп является наиболее распространенным типом флуоресцентного микроскопа. В этом типе возбуждение флуорофора и обнаружение флуоресценции осуществляются через один и тот же световой путь, т.е. возбуждающий и излучаемый свет проходят через линзу объектива.

2. Конфокальный микроскоп

Конфокальный микроскоп — это микроскоп, в котором используется пространственное точечное отверстие для блокирования света, находящегося вне фокуса, и используется только свет из плоскости фокуса для создания трехмерного изображения с более высоким разрешением и контрастностью изображения. Его также называют конфокальным лазерным сканирующим микроскопом.

Это тип флуоресцентного микроскопа, который используется для получения 2-D или 3-D изображений относительно толстых образцов. В этом типе свет возбуждения фокусируется на определенном пятне образца, лежащем в фокальной плоскости. Фокусное пятно подвергается оптическим манипуляциям для сканирования всего образца и создания трехмерного изображения. Получается изображение высокого разрешения с лучшей контрастностью.

Этот тип микроскопа использует лазерный свет для освещения. Использование конфокальной апертуры и колеблющегося зеркала позволяло сфокусировать лазерный луч в определенном месте. Они пренебрегают фоновым шумом от несфокусированных пятен и предотвращают быстрое фотообесцвечивание и рассеивание света. 

Он основан на методе оптического секционирования, при котором несколько 2D-изображений объединяются в 3D-изображение. 

Лазерный свет используется для освещения. Лазер проходит над образцом, окрашенным флуорофором. Испускаемый флуоресцентный свет проходит через точечное отверстие, расположенное на оптическом пути. Он выборочно позволяет излучаемому свету из сфокусированной точки проходить, блокируя все другие фоновые источники света. Свет преобразуется в электрический сигнал с помощью фотоумножителя. Компьютерное программное обеспечение анализирует электрический сигнал и создает трехмерное изображение.

Применение конфокальных микроскопов

1. Используется для выявления заболеваний роговицы глаза и грибковых клеток в соскобах с роговицы.
2. Используется для контроля качества фармацевтической продукции.
3. Используется в оптическом 3D-сканировании и визуализации.

Ограничения конфокального микроскопа

1. Ограниченная длина волны возбуждения и узкие полосы.
2. Дорогая система.

4. Многофотонный микроскоп

Это разновидность флуоресцентного микроскопа, в котором для возбуждения молекул флуорофора использует более одного фотона. Многофотонное возбуждение флуоресценции приводит к трехмерному изображению высокого разрешения. Наиболее распространены микроскопия с двухфотонным и трехфотонным возбуждением.

5. Флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения

Это тип флуоресцентного микроскопа, который используется для выборочной визуализации молекул флуорофора в водной среде вблизи твердой поверхности с высоким показателем преломления. Его преимуществами являются изображения высокого разрешения с лучшим контрастом, уменьшенным фоном и более яркими четкими изображениями.

Использование флуоресцентного микроскопа

1. Изучение строения фиксированных и живых клеток и клеточных органелл.
2. Используется для измерения физиологического состояния клеток.
3. Обнаружение кислотоустойчивых бактерий, малярийных паразитов и других микроорганизмов в клинических образцах.
4. Используется в иммунологии и биохимии для изучения макромолекул и нуклеиновых кислот.
5. Используется в методе флуоресцентной гибридизации на месте при изучении микробной экологии. 

Ограничения флуоресцентного микроскопа

1. Фотообесцвечивание ограничивает временной интервал наблюдения за образцом.
2. Фототоксические эффекты флуорофора.
3. Необходимость специфического флуорофора для окрашивания определенных структур.

5. Электронный микроскоп

Электронный микроскоп — это микроскоп, в котором вместо световых лучей используются пучки ускоренных электронов для освещения образца и получения сильно увеличенного изображения. В этом микроскопе стеклянные линзы заменены электромагнитами. Благодаря очень короткой длине волны электронов этот микроскоп дает изображение очень высокого разрешения с увеличением до 10 000 000 раз. Изображения получаются очень высокого качества с очень высокой контрастностью, раскрывающие детализированные структуры. Образцы размером до 0,2 нм можно хорошо рассмотреть с помощью электронного микроскопа.

Принцип электронного микроскопа

Электронный микроскоп использует ускоренные электроны с длиной волны примерно в 100 000 раз короче, чем видимый свет, для освещения образцов и получения изображений. Электронная пушка, обычно представляющая собой нагретую вольфрамовую или автоэмиссионную нить, используется для создания потока электронов высокого напряжения (100–1000 кВ). Эти электроны ускоряются с помощью анодной пластины в вакуумной системе и фокусируются на образце с помощью апертуры и электромагнитных линз. 

Электронный пучок проходит через образец и взаимодействует с компонентами образца. При ударе об образец электроны рассеиваются. Степень рассеяния зависит от показателя преломления или толщины образца. 

Рассеянные электроны от образца собираются и проходят через электромагнитные линзы объектива и окуляра. Эти рассеянные лучи обнаруживаются и преобразуются в сильно увеличенные изображения магнитными линзами.

Детали электронного микроскопа

Типичный электронный микроскоп состоит из следующих частей:

1. Электронная пушка (источник электронов)

Это устройство, которое генерирует электронные лучи для освещения образца. Он содержит катод и анод. Катод обычно представляет собой вольфрамовую нить. Когда вольфрамовая нить нагревается с помощью тока высокого напряжения в вакууме, высвобождаются электроны. 

Отрицательный колпачок вокруг нити удерживает выпущенные электроны в сфокусированный электронный пучок, который ускоряется положительным анодом по направлению к образцу. 

2. Электромагнитные линзы 

В отличие от световых микроскопов, в которых для увеличения используются стеклянные линзы, в электронном микроскопе используются магнитные поля, создаваемые магнитными катушками (электромагнитами). Этот тип линз позволяет электронам с определенной энергией проходить и блокировать другие электроны. Есть три типа электромагнитных линз:

1. Конденсорная линза, которая фокусирует пучок ускоренных электронов на образце в виде тонкого и узкого луча. 
2. Линза объектива, которая собирает электронный пучок, выходящий из образца после взаимодействия, и изгибает их для увеличения изображения.
3. Проекционные (окулярные) линзы, которые дополнительно увеличивают изображение, создаваемое линзами объектива.

3. Система апертуры

Это точечные отверстия, которые отфильтровывают нежелательные электроны от электронного луча до и после попадания в образец. Эта система содержит тонкие диски с микроскопическим отверстием диаметром от 2 до 100 мкм. Есть две апертуры: апертура конденсора под линзой конденсора и апертура объектива между линзами объектива и проектора.       

4. Держатель образца

Это платформа с механическим рычагом для удержания и позиционирования образцов в фиксированном положении. Он состоит из чрезвычайно тонкой углеродной пленки, удерживаемой металлической сеткой. 

5.   Вакуумная система

Все линзы, апертура, держатель образца и образцы расположены в закрытой вакуумной колонке. Для поддержания вакуума используются высокоэффективные вакуумные насосы. Вакуум позволяет электронам генерировать и двигаться, не сталкиваясь и не рассеиваясь со своего пути. 

6. Система визуализации

Эта система включает в себя электромагнитные линзы для перефокусировки, увеличения и проецирования изображений, экран для проявления изображений и камеру для записи и отображения изображений. Экран обычно представляет собой фосфоресцентную пластину, которая светится при ударе электронов. Окончательное сформированное изображение называется электронной микрофотографией и отображается на фосфоресцирующей пластине или на мониторе. 

Типы электронных микроскопов

Существуют различные типы электронных микроскопов, из которых ПЭМ и СЭМ являются наиболее часто используемыми и важными типами. Некоторые распространенные типы электронных микроскопов:

1. Трансмиссионный электронный микроскоп (ПЭМ)

Трансмиссионный электронный микроскоп (ПЭМ) — это разновидность электронного микроскопа, в котором для получения увеличенного изображения образца используются проходящие электроны.

В этой системе используются очень тонкие образцы, не более 100 нм (примерно в 200 раз тоньше, чем образцы, используемые в сложном микроскопе). Электроны фокусируются на образце с помощью конденсорной линзы. Испускаемые электроны проходят через электромагнитные линзы объектива и окуляра и проецируются на флуоресцентный экран. Когда электроны попадают на флуоресцентный экран, проявляется увеличенное изображение. 

Это наиболее часто используемый электронный микроскоп. Он создает двухмерные черно-белые изображения с очень высоким разрешением и увеличением от 2 до 50 000 раз.  

2.  Сканирующий электронный микроскоп (СЭМ)

Сканирующий электронный микроскоп (СЭМ) — это тип электронного микроскопа, который сканирует образец высокоэнергетическим пучком электронов в растровой схеме сканирования и создает сильно увеличенное трехмерное изображение образца. 

СЭМ использует испущенные, обратно рассеянные и дифрагированные электроны для получения изображений, отражающих характерные морфологические особенности образца. 

SEM содержит некоторые дополнительные детекторы, такие как детекторы обратно-рассеянных электронов, детекторы вторичных электронов и детекторы рентгеновского излучения.

Сканирующий электронный микроскоп (СЭМ) и трансмиссионный электронный микроскоп (ПЭM)

Сканирующий электронный микроскоп (СЭМ)	Трансмиссионный электронный микроскоп (ПЭМ)
Изображение основано на испущенных и рассеянных электронах.	Изображение основано на прошедших электронах.
Создает трехмерное изображение.	Создает двумерное изображение.
Предоставляет информацию о морфологии и топографии.	Предоставляет информацию только о морфологии.
Более толстый образец может быть обработан.	Нужен очень тонкий образец.
Может разрешать объекты на расстоянии до 20 нм.	Может разрешать объекты на расстоянии до 1 нм.
Сравнительно меньшее увеличение, до 50 000X.	Более высокое увеличение, до 2 000 000X.

3. Отражательный электронный микроскоп (REM)

Это электронный микроскоп, который использует отраженные лучи рассеянных электронов для проявления изображения. Это комбинация методов дифракции, визуализации и спектроскопии.  

4. Сканирующий трансмиссионный электронный микроскоп (STEM)

Это электронный микроскоп, который сочетает в себе технологии СЭМ и ПЭM для получения изображения. 

5. Сканирующий туннельный микроскоп (СТМ)

Это электронный микроскоп, используемый для выявления атомных и молекулярных деталей поверхности образца с использованием явления туннелирования электронов. Вместо того, чтобы проникать в образец и отображать детали образца, сканируются и проецируются только атомы на поверхности образца в виде трехмерных изображений.

Использование электронного микроскопа

1. Используется в микробиологии для изучения структуры вирусов, жгутиков, пилей и бактериальных клеток.
2. Используется в кристаллографии и нанотехнологиях.
3. Изучает морфологию клеточных органелл.
4. Используется в криминалистике для баллистического исследования выстрелов.
5. Используется в геологии для изучения горных пород, минералов и драгоценных камней.
6. Используется для контроля качества, обнаружения изломов и трещин, разработки лекарств и анализа атомной структуры. 

Ограничения электронного микроскопа

1. Очень дорогая и сложная система.
2. Изображения черно-белые.
3. Для ТЭМ требуется очень тонкий образец.
4. Необходимость вакуумной системы.

6. Микроскоп темного поля

Микроскоп темного поля — это тип светового микроскопа, который использует только свет, рассеянный образцом, для получения яркого изображения с темным полем вокруг образца. Это модифицированный световой микроскоп, в котором используется дополнительный непрозрачный диск под линзой конденсора, который блокирует свет, исходящий от источника, и не достигает линзы объектива.

Этот микроскоп обеспечивает более высокое разрешение и лучшую контрастность, чем микроскоп светлого поля. Нет необходимости окрашивать образцы.

Использование микроскопа темного поля

1. Используется в микробиологии для наблюдения за подвижностью микробов, а также за спирохетами и другими очень тонкими бактериями. 
2. Используется для изучения капсулированных организмов.
3. Используется в цитологии для изучения внутренних органелл. 
4. Используется в компьютерной мыши, чтобы мышь могла работать над прозрачной средой.
5. Он сочетается с гиперспектральной визуализацией для характеристики наночастиц. 

Ограничения микроскопа темного поля

1. Любые загрязнения, такие как частицы пыли, могут рассеивать свет, создавая ложное изображение.
2. Тонкое нанесение образца обязательно 
3. Образцы должны быть влажными и сильно освещенными.

7. Препаровальный микроскоп (стереомикроскоп)

Препаровальный микроскоп или стереомикроскоп — это тип светового микроскопа, который использует свет, отраженный от поверхности образца, для получения изображения с малым увеличением. Он в основном используется при препарировании и просмотре препарированных образцов, поэтому его называют препаровальным микроскопом. Этот микроскоп может просматривать трехмерные объекты, в отличие от других световых микроскопов, которые рассматривают объекты, закрепленные на предметном стекле.

Препаровальный микроскоп или принцип стереомикроскопа

Стереомикроскоп использует две окулярные линзы, которые фокусируются на двух разных световых путях и создают стереоскопическое изображение. У них есть верхний свет, используемый для рассечения, и нижний свет, используемый для просмотра. Объективы стереомикроскопа находятся внутри цилиндрического конуса и, следовательно, не могут быть просмотрены, как в составных световых микроскопах. Столик также больше, чем обычный составной микроскоп. Обычно имеется канавка для предотвращения смещения образца.

Использование препаровального микроскопа или стереомикроскопа

1. Они используются в препаровальной и микрохирургической процедуре.
2. Изучение археологических артефактов и геологических образцов.
3. Используется в производстве и ремонте наноэлектроприборов, таких как часы, микрочипы, мобильные телефоны, печатные платы и т. д.

Ограничения препаровального микроскопа или стереомикроскопа

1. Имеет ограниченное использование.
2. Низкое увеличение.
3. Дорогостоящая система.

8. Цифровой микроскоп

Цифровой микроскоп — это тип микроскопа, в котором отсутствует окулярная линза, а вместо этого он содержит цифровую камеру и экран для отображения изображения в цифровом виде. Это современный микроскоп, представляющий собой компьютеризированную систему, объединяющую микроскоп с камерой, монитором, компьютерным программным обеспечением и процессором. 

Изображение или видео образца можно захватить и отредактировать. Программное обеспечение может выполнять различные анализы образца, такие как измерение размера, увеличение и фокусировка на определенных деталях, а также коррекция цвета и редактирование. 

Помимо основных частей составного микроскопа, в нем использовалась камера, заменяющая окуляры, и дополнительная система отображения. 

Компьютер может быть встроенным или подключенным извне для управления камерой и программным обеспечением для обработки изображений. Они могут проецировать 2-D и 3-D изображения. Программное обеспечение позволяет управлять цветовым контрастом, яркостью, записывать и обмениваться графикой и видео, а также выполнять другие манипуляции с изображениями.  

Применение цифрового микроскопа

Они используются в нескольких областях, включая микробиологию, патологию, цитологию, хирургические процедуры, нанотехнологии, судебную экспертизу, промышленные секторы и т. д. Они используются вместо составных микроскопов из-за их возможностей обработки и отображения изображений.

9. Сканирующий зондовый микроскоп (СЗМ)

Сканирующий зондовый микроскоп (СЗМ) — это тип микроскопа, в котором используется сканирующий зонд для сканирования поверхности образца и регистрации взаимодействия для получения изображения. Он проецирует детали поверхности атомов и молекул. 

Он включает в себя сканирующие туннельные микроскопы, атомно-силовые микроскопы, микроскопы жидкостного поля, сканирующую электрохимическую микроскопию, сканирующие тепловые микроскопы и т. д. В основном используются атомно-силовое поле и сканирующий туннельный микроскоп.

9.1 Атомно-силовой микроскоп (АТМ)

Атомно-силовой микроскоп (ATM) — это тип сканирующего зондового микроскопа, в котором используется отталкивающая электронная сила между наконечником зонда микроскопа и поверхностью образца для сканирования атомов на поверхности образца. Его также называют сканирующим силовым микроскопом. 

Он может измерять такие свойства образцов, как высота, трение и магнетизм. Изображение будет очень точным, а разрешение можно определить в миллиметрах. Он дает трехмерное изображение. Его также можно использовать для визуализации живых элементов.

Принцип работы атомно-силового микроскопа (АТМ)

Он работает путем измерения межмолекулярных сил и наблюдения за поверхностными атомами с помощью сканирующего зонда. Он функционирует на основе своих трех основных способностей, зондирование поверхности, обнаружение поверхности и визуализация.

Он выполняет поверхностное зондирование с помощью кантилевера. Кантилевер сканирует поверхность образца, создавая силу притяжения между поверхностью и его кончиком. Кантилевер отклоняется от поверхности, когда он подходит слишком близко к поверхности образца. При отклонении кантилевера меняется направление отражения луча, падающего на поверхность. Фотодиод с положительной чувствительностью регистрирует отклонение кантилевера и изменение направления отражения луча. Это отклонение и изменение отражения луча используются для получения точного изображения поверхности образца.

Детали атомно-силового микроскопа (ATM)

1. Консольный — это пластина из кремния или нитрида кремния с наконечником с радиусом в нанометровом масштабе. Используется для сканирования поверхности образца.
2. Система измерения прогиба — эта система измеряет отклонение кончика кантилевера и оптического луча. Эта мера отклонения используется для картирования поверхности образца. PSPD используется для записи изменения отклонения и отражения светового луча. 
3. Система измерения силы — эта система измеряет силу взаимодействия между поверхностными атомами и наконечником кантилевера. Эта система работает на основе закона Гука. 

Использование атомно-силового микроскопа (ATM)

1. Используется для анализа физических свойств, таких как магнетизм, трение, электрические свойства, вязкоупругость и т. д.
2. Используется для идентификации соединений, кристаллов и элементов.
3. Используется в патологии для изучения раковых клеток.
4. Используется для визуализации и изучения макромолекул, таких как белки и нуклеиновые кислоты.

Ограничения атомно-силового микроскопа (ATM)

1. Анализ занимает больше времени, поэтому термический дрейф образца представляет собой серьезную проблему.
2. Ограниченное увеличение.
3. За один раз он выдает изображение очень небольшой площади (всего около 150 нм × 150 нм)

10. Инвертированный микроскоп

Инвертированный микроскоп — тип светового микроскопа, объективы и турель которого находятся под столиком, а осветитель и конденсор — над столиком. 

Его принцип работы и приборы аналогичны простому/составному/прямому микроскопу, но положение источника света, турели, объективов перевернуто. В некоторых оцифрованных типах камера фиксируется для фото- или видеосъемки образцов.

Использование инвертированного микроскопа

1. Используется в металлургических процессах для наблюдения за металлами и минералами.
2. Используется в цитологии для изучения процесса деления клеток и наблюдения за мельчайшими живыми организмами.
3. Используется в микробиологии для выявления M.tuberculosis, Phytopthora spp. в культуре.

Ограничения инвертированного микроскопа

1. Очень ограниченное количество и дорого.
2. Толщина предметного стекла или чашки, используемых для удерживания образца, влияет на визуализацию.

11. Акустический микроскоп

Акустический микроскоп — это тип микроскопа, который использует очень высокочастотные ультразвуковые волны вместо света или электронов для получения увеличенного изображения объекта. Он использует звуковые волны для сканирования образца, а отраженный звук обрабатывается электронным способом для создания изображения. Поэтому он называется акустическим. Он использует ультразвуковой звук, поэтому его также называют ультразвуковым микроскопом. Обычно используются звуковые волны от 5 МГц до 400 МГц.  

Принцип акустического микроскопа

Преобразователь преобразует электрический сигнал в ультразвуковой. Звуковые волны фокусируются на образце с помощью связующей жидкости. Звук попадает на образец, и одни волны отражаются, а другие передаются.

Визуализация делается двумя методами. Режим импульсного эха и режим передачи. В режиме Pulse-Echo используется один преобразователь и обрабатываются амплитуда, фаза и время возврата отраженного звука (эха). В режиме передачи используются два преобразователя. Один принимает переданную звуковую волну, а другой принимает отраженную звуковую волну. В обоих методах образец сканируется пиксель за пикселем и создается плоское (двухмерное) изображение. 

Детали акустического микроскопа

Основным прибором, используемым в акустическом микроскопе, является преобразователь. Он преобразует электрический сигнал в ультразвуковую волну, а также повторно преобразует полученный звук в электрический сигнал. Затем компьютерное программное обеспечение преобразует полученный электрический сигнал в изображение. Эти типы микроскопов позволяют просматривать внутреннюю структуру образца. Выбирается даже признак субмикронного уровня. Он может защитить целостность образца и получить информацию о внутренних символах.

Использование акустического микроскопа

1. Используется в основном при контроле качества и производстве электронных устройств, изображений печатных плат, обнаружении трещин в микросхемах и т. д.
2. Используется в химической, фармацевтической, керамической промышленности и т. д. для проверки качества продукции.
3. Используется в цитологическом и гистологическом исследовании для изучения внутренней структуры клеток, подвижности клеток, эластичности и др.

Ограничения акустического микроскопа

1. Звуку нужна среда для путешествия.
2. Трудно манипулировать звуками.
3. Медленное время обработки.
4. Дорого.

12. Рентгеновский микроскоп

Рентгеновский микроскоп — это тип оптического микроскопа, который использует луч рентгеновских лучей для освещения образцов и получения их увеличенного изображения. Рентген легко проникает в большинство объектов, поэтому с его помощью можно получать изображения любых объектов без специальной подготовки и окрашивания. Обычно используются рентгеновские лучи с энергией 100–1000 эВ, что соответствует длине волны около 1 нм. Современные рентгеновские микроскопы используют рентгеновские лучи с длиной волны от 0,1 до 10 нм.  

Принцип рентгеновского микроскопа

Он разработан на основе того, что молекулы вещества при взаимодействии с рентгеновскими лучами ионизируются. Электроны атомов ионизированных молекул возбуждаются в более высокое энергетическое состояние. Возбужденные электроны возвращаются в свое основное состояние, излучая энергию возбуждения в виде рентгеновских лучей. Эти испускаемые рентгеновские лучи имеют определенную энергию и длину волны, соответствующие характеристике элемента.

Рентгеновские лучи производятся в рентгеновской трубке и фокусируются на образце для освещения образца. Когда высокоэнергетическое рентгеновское излучение попадает на образец, часть его рассеивается, часть проникает в образец, а часть поглощается. 

Молекулы ионизируются, а электроны переходят в более высокое энергетическое состояние. Возбужденный образец испускает рентгеновское излучение с определенной длиной волны, соответствующей типу атомов в образце. 

Изображение образца проявляется либо фотометодом, либо детекторной системой. На фотографиях метод изображения проявляется, когда испускаемый рентгеновский луч попадает на рентгеновскую пластину или фосфоресцентную пластину. В детекторной системе устройство с зарядовой связью или сцинтилляционный детектор или другие детекторы рентгеновского излучения используются для обнаружения испускаемого рентгеновского излучения и преобразования его в электрические сигналы. Электрические сигналы обрабатываются компьютером, а изображение выводится на монитор.

Части рентгеновского микроскопа

1. Рентгеновская трубка

Это электронно-лучевые трубки, которые производят рентгеновские лучи. Он включает в себя вакуумную систему, содержащую металлические анодные пластины и катод. Катод обычно представляет собой вольфрамовые нити, которые производят электронные пучки при нагревании электрическим током высокого напряжения. При ударе о металлическую пластину электроны внезапно замедляются, высвобождая рентгеновские фотоны, содержащие энергию, соответствующую ударяющим электронам. 

2. Коллиматор

Это устройство, которое фокусирует производимые рентгеновские лучи в параллельный пучок, и этот процесс называется коллимацией. Коллиматор состоит из двух наборов плотно упакованных металлических пластин, разделенных узким зазором в 0,5 микрометра или меньше. Эти пластины поглощают все рентгеновские лучи, но позволяют узкому лучу проходить через зазор, образуя коллимированный рентгеновский пучок.

3. Монохроматор

Это оптическое устройство, используемое для поляризации неполяризованного пучка рентгеновских лучей. Монохроматором может быть либо фильтр, пропускающий определенную длину волны и поглощающий все остальные нежелательные излучения, либо кристалл (кристаллы кварца, NaCl, LiF и т. д.). 

4. Система обнаружения

Он включает в себя детекторы, которые обнаруживают испускаемые рентгеновские лучи для визуализации. Используются различные типы детекторов.

Использование рентгеновского микроскопа

1. Используется для идентификации и характеристики кристаллов и полимеров.
2. Используется в металлургии, нефтяной, керамической и стекольной промышленности для контроля качества. 
3. Используется в геологии для изучения горных пород, минералов и состава почвы.

Ограничения рентгеновского микроскопа

1. Сложность визуализации.
2. Дорогой, трудоемкий процесс и сложная аппаратура.

13. Поляризационный микроскоп

Поляризационный микроскоп — это особый тип светового микроскопа, который использует поляризованный свет для освещения образца и проявления его увеличенного изображения. Он похож на обычный оптический микроскоп, но использует поляризованный свет вместо обычного естественного света. Это повышает качество изображения и контрастность изображения. Их еще называют петрографическими микроскопами.

Принцип поляризационного микроскопа

Нормальный свет, исходящий от осветителя, проходит через поляризатор, который преобразует нормальный свет в плоскополяризованный свет. Поляризационный микроскоп фокусирует плоскополяризованный свет на анизотропный (вещество с несколькими показателями преломления) образец. Когда поляризованные световые волны падают на такой анизотропный образец, возникает двойное лучепреломление (двойное отражение), генерирующее две волны, обыкновенную и необыкновенную, которые перпендикулярны друг другу. Эти две волны передаются в разных фазах. Анализатор объединяет эти две волны и пропускает их через окулярную линзу для получения увеличенного изображения.

Части поляризационного микроскопа

Он содержит все части обычного светового микроскопа и дополнительно добавлено несколько оптических устройств, а именно:

1. Поляризатор

Это фильтр, который поляризует неполяризованный свет, генерируемый источником света. Он помещается между предметным столиком осветителя и предметным столиком.

2. Анализатор

Это еще один поляризационный фильтр, который размещается на оптическом пути над линзами объектива.  

3. Дополнительные пластины

К ним относятся компенсаторные и замедляющие пластины. Они определяют разность оптических путей или относительное запаздывание между обыкновенной и необыкновенной волнами, возникающими при двойном лучепреломлении. Эти пластины изготавливаются перед анализатором. Они делают изображения более контрастными и помогают четко визуализировать внутренние структуры.  

4. Специализированная сцена

В поляризационных микроскопах используется круглый предметный столик, который может двигаться на 360°.

Использование поляризационного микроскопа

1. Используется в геологических исследованиях для изучения горных пород, минералов и компонентов почвы.
2. Используется для изучения внутреннего строения прозрачных планктонов, диатомей, простейших и др.

Ограничения поляризационного микроскопа

1. Требует анизотропный образец.
2. Имеет ограниченные приложения.