Содержание
Белки — это макромолекулы, состоящие из аминокислот. В природе описано около 500 различных аминокислот, но, что интересно, только 20 из них являются незаменимыми, присутствующими в организме человека. ДНК содержит всю информацию, необходимую для синтеза белка, поскольку с помощью механизмов транскрипции и трансляции триплет нуклеотидов ДНК превращается в определенную аминокислоту.
Рибосомы — это органеллы, ответственные за сборку этих аминокислот, дающую начало цепям с порядком и переменной длиной. Эти биомолекулы необходимы для зачатия жизни, поскольку на их долю приходится примерно 80% сухой протоплазмы в каждой клетке и 50% веса всех живых тканей.
Что такое метод Брэдфорда?
Метод Брэдфорда был описан американским ученым Мэрион Маккинли Брэдфорд в 1976 году. Прежде всего, необходимо подчеркнуть, что это спектрометрический метод, термин, охватывающий комплекс лабораторных процедур, основанный на взаимодействии электромагнитного излучения с аналитом (представляющий интерес компонент, который нужно отделить от матрицы).
В дополнение к этому следует отметить, что это метод колориметрического характера, то есть он дает результаты на основе цветов и их концентрации в конкретном растворе. Ключ к этому терминологическому конгломерату находится в красителе «Кумасси синий», поскольку метод Брэдфорда количественно определяет изменения его поглощения в соответствии с определенными параметрами. Этот краситель имеет синий цвет в своей анионной форме, зеленый в своей нейтральной форме и красный в своей катионной форме.
В кислых условиях в растворе синий кумасси меняет цвет с красного на синий и при этом связывается с белками, подлежащими количественному определению. Если в водной среде нет белков, смесь остается коричневой, поэтому с помощью этой методологии очень легко обнаружить присутствие этих макромолекул в первую очередь.
Химические основы метода Брэдфорда
При соединении с белком кумасси синий в его катионной и двупротонированной форме (красный) образует очень прочную нековалентную связь с указанной макромолекулой за счет сил Ван-дер-Ваальса и электростатических взаимодействий.
Во время образования этого химического комплекса краситель отдает свой свободный электрон ионизируемым частям белка (помните, что катион = положительный заряд, он теряет электроны), что вызывает нарушение нормального состояния белка. Это обнажает определенные вещества, которые могут образовывать ранее описанные союзы, на которых мы не собираемся останавливаться из-за их химической сложности. Таким образом, вам нужно знать только следующее:
Красный краситель (катионный / не связанный с белком) ≠ Синий краситель (анионный / связанный с белком)
Основываясь на этой предпосылке, следует отметить, что красный краситель имеет спектр поглощения 465 нм, значение, которое представляет падающее электромагнитное излучение, которое материал поглощает в диапазоне частот. В анионной синей форме (взаимодействующей с белками) изменение поглощения происходит при 595 нм. Следовательно, в растворе, подвергнутом методу Брэдфорда, показания снимаются на спектрофотометрах в диапазоне 595 нм.
Увеличение оптической плотности в этом спектре прямо пропорционально количеству связей между красителем и белками, поэтому не только обнаруживается наличие белков с изменением цвета, но также можно оценить, сколько белка имеется в расчете на один цвет.
Процедура по методу Брэдфорда
Для реализации этой методики необходим спектрофотометр, который стоит недешево (примерно 2000 евро), поэтому им нельзя пользоваться дома. Эта машина способна проецировать монохроматический луч света через образец, чтобы измерить количество света, которое поглощается интересующими соединениями. Таким образом, исследователь получает информацию о природе молекул в рассматриваемом растворе и, кстати, также может рассчитать концентрацию указанной молекулы.
100 миллиграммов красителя следует растворить в 50 миллилитрах 95% раствора этанола и добавить 100 миллилитров 85% фосфорной кислоты. Кроме того, после растворения красителя необходимо разбавить его до литра и профильтровать смесь, чтобы получить окончательный реагент, используемый в методе. Цвет этого раствора без белков, как мы уже сказали, должен быть коричневатым.
Получив реагент и спектрофотометр, исследователь должен выполнить следующие шаги:
- Подготовьте спектрофотометр и проверьте его правильность работы.
- Приготовьте раствор белка для анализа. В идеале этот образец должен содержать от 5 до 100 микрограммов белка на 100 микролитров общего раствора. Очевидно, что точная концентрация неизвестна, но это максимальное и минимальное значения.
- Добавьте в раствор 5 миллилитров реагента и дайте ему инкубироваться в течение 5 минут.
- Измерьте оптическую плотность смеси на спектрофотометре при 595 нм.
Результаты появятся на экране спектрофотометра и должны быть отмечены профессионалом, проводящим расследование. Как только они будут получены, необходимо построить график (калибровочную кривую), на осях которого будут стоять два значения: абсорбция против микрограммов белка. Из кривой, построенной со значениями, их можно экстраполировать для получения точной концентрации белка в растворе.
Преимущества
Метод Брэдфорда очень легко применить для всех, кто имеет отношение к лабораторной сфере, поскольку каждый биолог и химик хотя бы раз сталкивался со спектрофотометром за годы обучения. Будь то измерение количества хлорофилла в растворе, от раздавливания листа до гораздо более сложных вещей, спектрофотометры очень широко распространены в областях обучения.
Помимо простоты, следует отметить, что многие белки в их естественном состоянии имеют чрезвычайно низкий диапазон поглощения — 280 нм. Даже не все белки достигают этого значения, потому что для этого они должны иметь определенные аминокислоты (тирозин, фенилаланин и триптофан), которые не всегда присутствуют. Поскольку этот показатель поглощения находится в УФ-диапазоне, необходима специальная машина, которую почти никто не должен обрабатывать.